海藻酸盐释放的二价阳离子诱导新骨形成。(a)重建的微计算机断层扫描(µCT)图像(比例尺= 1 mm)显示移植了Mg2+-、Cu2+-或Zn2+-释放藻酸盐的小鼠股骨中的新骨形成。以纯海藻酸盐移植小鼠为对照。(b)相应的骨体积分数(BV/TV)、骨密度(BMD of TV)和骨皮质面积(Ct.Ar)的测量。(c)苏木精和伊红(H&E)染色显示骨膜新骨形成的代表性图像(n = 3)。下方图像(比例尺= 100µm)是上方图像(比例尺= 500µm)中盒装区域的高分辨率版本。P,骨膜;NB，新骨;OB，老骨;米,骨髓。 d Representative immunofluorescent images showing the presence of osteocalcin+ (OCN+) osteoblasts on the cortical bone surface. Lower images (scale bars = 50 µm) are high-resolution versions of the boxed regions in the upper images (scale bars = 200 µm). P, periosteum; Ct, cortical bone. (e) Representative images of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining showing the presence of TRAP+ osteoclasts on the cortical bone surface. Lower images (scale bars = 100 µm) are high-resolution versions of the boxed regions in the upper images (scale bars = 400 µm). (f) Histomorphological analysis of osteoblast (N.Ob/Ct.B.Pm) and osteoclast (N.Oc/Ct.B.Pm) numbers on the cortical bone surface. Representative images of calcein/xylenol labeling showing periosteal new bone formation (g, scale bars = 100 μm), quantitative analysis of fluorescence intensity of calcein and xylenol (h), as well as corresponding measurement of bone formation rate (i). Data are mean ± standard deviation (s.d.) *P < 0.05, **P < 0.01 by 1-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey’s post hoc test. Source data are provided as a source data file. Credit:自然通讯， DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-28203-0
二价阳离子刺激巨噬细胞分泌前列腺素E2 (PGE2)。(a)术后第1周骨膜内有分化68簇(CD68)的环氧合酶-2 (COX2)共免疫染色(比例尺= 100µm)。(b)术后第1周定量骨皮质表面巨噬细胞数量和骨膜COX2强度。酶联免疫吸附试验(ELISA)分析术后第1周和第4周骨(c)和血清(d) PGE2浓度。e ELISA分析(n = 3)显示不同浓度Mg2+、Zn2+或Cu2+对骨髓巨噬细胞(BMM)释放PGE2的影响。f在添加不同浓度Mg2+、Zn2+或Cu2+的培养液中培养3天后，实时聚合酶链反应分析小鼠BMM中PTGES mRNA的表达(n = 3)。g小鼠BMM中不同二价阳离子对COX2表达影响的代表性Western blot及相应定量(n = 3)。h流式细胞术筛选YFP+巨噬细胞的门控策略和显示术后第1周巨噬细胞中PTGES和COX2 mRNA表达的RT-qPCR数据(n = 3)。i不同二价阳离子对小鼠BMM中NF-κB和i κ b α磷酸化的影响的代表性Western印迹和相应定量(n = 3)。j染色质免疫沉淀实验显示，Mg2+刺激COX2启动子NF-κB p65上调(n = 3)。 Data are mean ± s.d. n.s. (nonsignificant), *P < 0.05, **P < 0.01 by one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test (b, e–i) or two-way ANOVA with Tukey’s post hoc test (c, d). Source data are provided as a source data file. Credit:自然通讯， DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-28203-0
巨噬细胞来源的PGE2介导二价阳离子诱导的骨形成。重建µCT图像(a，比例尺= 1 mm)，显示注射白喉毒素后LysM或iDTRLysM+/−小鼠股骨的横截面和相应的测量值(b) BV/TV, TV的BMD和CT . ar。重建µCT图像(c，比例尺= 1 mm)，显示SW033291给药后小鼠股骨的横切面和相应的BV/TV、TV的BMD和CT . ar的测量值。重建的µCT图像(e，比例尺= 1 mm)显示了移植纯藻酸盐或Mg2+释放藻酸盐的COX2wt小鼠或COX2LysM−/−小鼠股骨的横截面，以及相应的BV/TV、TV的BMD和CT . ar的测量值(f)。g显示COX2wt或COX2LysM−/−小鼠骨膜新骨形成的代表性H&E染色图像(n = 3)。下方图像(比例尺= 100µm)是上方图像(比例尺= 500µm)中盒装区域的高分辨率版本。h具有代表性的免疫荧光图像及其定量显示骨皮质表面存在OCN+成骨细胞(比例尺= 100µm, n = 3)。i骨皮质表面TRAP+破骨细胞存在的代表性TRAP染色图像及定量(比例尺= 100µm, n = 3)。数据为均数±标准差。，*P < 0.05, **P < 0.01 by one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test (b, f, h, i) or Student’s two-sided T-test (d). Source data are provided as a source data file. Credit:自然通讯， DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-28203-0
感觉神经的缺失可消除二价阳离子诱导的骨形成。(a, b)术后第1周骨膜内降钙素基因相关多肽-α+ (CGRP+)感觉神经发芽和树突化的代表性免疫荧光图像和相应定量。下方图像(比例尺= 20µm)是上方图像(比例尺= 100µm)中盒装区域的高分辨率版本。(c)术后第1周骨膜CGRP与CD68共免疫染色。下方图像(比例尺= 20µm)是上方图像(比例尺= 100µm)中盒装区域的高分辨率版本。L4腰椎负责左股骨感觉的DRG于术后第1周采集，用于组织学研究(d)、代表性免疫荧光图像(e)和相应的定量(f)，显示CGRP的表达(比例尺= 100µm)。g具有代表性的免疫荧光图像显示TrkAwt或TrkAAvil−/−小鼠股骨中存在CGRP+感觉神经。下方图像(比例尺= 50µm)是上方图像(比例尺= 100µm)中盒装区域的高分辨率版本。重建µCT图像(h，比例尺= 1 mm)，显示移植纯藻酸盐或Mg2+释放藻酸盐的TrkAwt小鼠或TrkAAvil−/−小鼠股骨的横切面，以及相应的BV/TV、TV的BMD和CT . ar的测量值(i)。数据为均数±标准差。， *P < 0.05, **P < 0.01 by one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test. Source data are provided as a source data file. Credit:自然通讯， DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-28203-0
敲除感觉神经中PGE2受体4 (EP4)可消除二价阳离子诱导的骨形成。(a) EP4在10 mM Mg2+刺激DRG神经元中的表达，与Mg2+处理的巨噬细胞的条件培养基一起或不一起(n = 3)。重建的µCT图像(b，比例尺= 1 mm)、相应的测量值(c)和显示EP4wt小鼠或EP4Avil−/−小鼠(n = 3)中新骨形成的代表性H&E染色图像(d)。下面的图像是上面图像(比例尺= 500µm)中盒装区域的高分辨率版本(比例尺= 100µm)。e术后第4周EP4wt或EP4Avil−/−小鼠跑轮活性。f术后第1周EP4wt或EP4Avil小鼠VMH中CREB的磷酸化情况(n = 3，比例尺= 200µm)。重建的µCT图像(g，比例尺= 1 mm)、相应的测量值(h)和代表性的H&E染色图像(i)显示注射了载药(Veh)或普萘洛尔(PROP)的小鼠的新骨形成。下方图像(比例尺= 100µm)是上方图像(比例尺= 500µm)中被框住的区域的高分辨率版本。j术后第4周注射维卡尔或心得安小鼠的跑轮活动。k显示本研究结果的示意图。二价阳离子触发巨噬细胞产生PGE2，激活感觉神经的EP4，通过VMH中的CREB信号下调交感神经信号，导致骨膜中成骨增加和破骨细胞生成减少。 Data are mean ± s.d. *P < 0.05, **P < 0.01 by one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test (a, c, e, h, j). Source data are provided as a source data file. Credit:自然通讯， DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-28203-0
