废水中冠状病毒自动高灵敏度检测方法的开发

AdvanSentinel公司、盐野木株式会社和北海道大学工学院副教授Masaaki Kitajima开发了一种高灵敏度的废水中SARS-CoV-2 RNA检测技术，其中大部分步骤与自动化兼容。

基于废水的流行病学是一种有效的工具，用于了解2019冠状病毒病(以下简称“COVID-19”)在人群水平上的流行情况，包括无症状和轻度症状患者。盐野木和北海道大学一直在进行合作研究自2020年10月起，面向基于废水的流行病学的社会实施。在COVID-19流行率较低的地区(如大流行早期的日本)，废水中的病毒浓度相对较低，由于缺乏敏感性，难以用常规方法定量检测病毒RNA。

这项合作研究的主要目标之一是开发一种高灵敏度的废水病毒检测方法，这对日本基于废水的流行病学的社会实施至关重要。基于此背景，该团队最近报道了EPISENS-S方法的发展，这是一种高灵敏度和实用的废水中病毒RNA检测方法。

此外，正在努力建立一个能够分析大量样本的自动化分析系统，这是国家一级社会实施所需要的。因此，该团队成功开发了利用磁珠检测废水中核酸的凝固和蛋白质水解法(COPMAN法):一种高灵敏度的检测技术，适用于自动化。该研究结果已在网上发表全环境科学2022年9月23日。

COPMAN方法通过在废水中的病毒浓缩过程中使用混凝剂，实现了快速稳定的病毒回收，预计不仅可以有效检测SARS-CoV-2病毒，还可以有效检测其他病毒。预计COPMAN方法的传播将进一步加速基于废水的流行病学的社会实施，因为用人形机器人实施该方法可以分析大量的样本。

AdvanSentinel和Shionogi正在与北海道大学(Hokkaido University)合作开发基于废水的流行病学技术，从而能够更准确地了解传染病的流行情况。我们将帮助解决一个紧迫的问题，了解COVID-19的流行情况(包括变种)，并继续建立全国性废水监测系统，以确定COVID-19之后可能发生的下一次大流行的公共卫生威胁和风险。

研究结果详情

本研究开发的COPMAN方法包括以下步骤:用混凝剂浓缩废水中的病毒，用磁珠提取和纯化RNA，逆转录(RT)-预扩增-定量PCR (qPCR)。聚乙二醇(PEG)沉淀法是日本使用最广泛的方法，其病毒浓缩步骤需要9个多小时，而使用混凝剂可使COPMAN方法在短短10分钟内完成这一步骤。

此外，该方法通过在RT-preamplification-qPCR步骤中使用含有酶的独特裂解缓冲液提取RNA，确保了废水中病毒RNA的高灵敏度检测。裂解缓冲液中含有酶，在RT-preamplification-qPCR步骤中结合一组抑制抗性酶降解病毒蛋白。

利用12份含有较低浓度病毒RNA的城市污水样本(即污水处理厂收集的进水废水)，我们将COPMAN方法与PEG沉淀法和超滤法进行了比较，然后进行了常规qPCR。COPMAN方法的检出率为100%(12/12样品)，远高于PEG沉淀法和超滤法的检出率(分别为17%(2/12样品)和42%(5/12样品)，表明COPMAN方法具有较高的灵敏度。

COPMAN方法还可以量化粪便中含有的辣椒轻度斑驳病毒(PMMoV)，从而可以通过PMMoV浓度归一化SARS-CoV-2 RNA浓度(即可以纠正粪便负荷波动和雨水稀释的影响)。

虽然废水中的大多数SARS-CoV-2与固体部分有关，但已知包括PMMoV在内的许多非包膜病毒不仅在固体部分中存在高比例，而且在液体部分中也存在高比例。COPMAN方法可以有效地恢复病毒由于在浓缩步骤中使用了混凝剂，废水中除固体馏分中的液体馏分外;事实上，COPMAN法的PMMoV产率比EPISENS-S法的高，EPISENS-S法只分析固体部分。

因此，我们认为COPMAN方法可以有效地检测各种病毒，包括大量存在于液体馏分中的病毒，如PMMoV和诺如病毒。

COPMAN方法由于与自动化不兼容，尽量省去了离心过程，采用磁珠核酸纯化方法，更适合自动化。这一创新使大量标本的分析成为可能，而这一技术的传播有望进一步加速社会的实施废水的流行病学。